Micro
RNA (miRNA) và Phương Pháp Trị Liệu Bệnh Ung Thư
Tiến sĩ Vũ Mạnh Huỳnh
Lịch sử, tiến trình sinh
sản, và phận sự của miRNA trong sinh học:
miRNA là những đoạn RNA ngắn khỏang từ 19 - 22 nucleotide đã được phát
hiện từ lâu trong di truyền vi sinh vật, động vật, thực vật và người.
Nhưng mãi cho dến năm 1993, việc tách ly, phân tích định tinh của miRNA
đầu tiên lin-4 và let-7 của sâu mang đơn tế bào Caenorhabditis elegans,
sinh sống ở trong đất, rau đậu bị hư thối, mới được hoàn tất. Hai miRNA
này mang một vai trò quan trọng trong việc điều tiết trong thời kỳ sinh
sản ra nhộng (larval development) của loài sâu đất này. Mặc dầu công trình
nghiên cứu về phận sự của miRNA trong tế bào chưa được hoàn toàn thành
công, nhưng các chuyên gia đã có bằng chứng cho thấy rằng sự hiện diện
của miRNA có liên quan đến sự tăng trưởng của mô, tế bào. Khác với mRNA
(messenger RNA), miRNA không dự phần vào việc sinh sản ra protein, nên
đã được đặt tên là non-protein coding RNA. Trong các chương trìng nghiên
cứu y dược, các chuyên gia trong ngành, thông thuờng đã chỉ nhắm đến cách
tổng hợp các hóa chất, peptide nhân tạo, mang tính chất làm trở ngại,
tàn phá, làm triệt tiêu cơ chế phát sinh protein, hay chính protein có
hại cho đối tác là nông nghiệp và nhân loại. Cũng vì không nắm vai trò
sinh sản ra protein cho nên miRNA đã bị lãng quên trong quá trình nghiên
cứu y dược. Trong quá trình sinh học, miRNA Gene đã được tác động bởi
enzyme RNA Polymerase II, chuyển hoán và sinh sản ra microRNA nguyên thủy,
được gọi la pri-miRNA. Đây là chuỗi RNA dài hàng nghìn base, và mang đầu
5'-CAP, và đầu 3' là gốc đa A (Poly-A, AAAA...). Những pri-miRNAs này
chứa đựng ít nhất là một, hay nhiều vòng Hairpin, mỗi vòng dài khoảng
~70 nucleotides. Cũng như tất cả các RNA khác, kể cả mRNA, pri-miRNA bị
tác động cắt đoạn bởi hai enzymes, một là DROSHA, ở trong nhân, và hai
là DICER, ở ngoài nhân, trong tế bào cha^’t (Cytoplasm). Sự cắt đoạn này
đã sinh sản ra các đoạn miRNA, có hoạt tính tương tự như siRNA (small
interfering RNA), sẽ kết hợp với RNA Interference (RNAi), dưới sự hiện
diện của RISC (RNA-induced Silencing Complex), miRNA sẽ tác động lên một
phần của mRNA, dưới dạng kết hợp Base-pairing, để làm tiết chế việc tiếp
tục sinh sản, hay phân giải mRNA, đã phát sinh trong tế bào. Sự chuyển
hoán trong quá trình sinh học sinh sản ra miRNA, và quá trình tác động
của miRNA lên mRNA được mô tả trong Hình 1.
Hình 1: Tiến trình phát sinh và cơ chế phản ứng của microRNA
trong sinh thể, nội dung của tiến trình được tóm tắt như sau:
1. miRNA có chiều dài khoảng
19-24 nucleotides, sinh sản từ tác động cắt đoạn của các Haipin trong
pre-miRNA, dài khoảng 60 - 110 nucleotides, bởi hai enzymes DROSHA, và
DICER.
2. Gần 70% các miRNA được
phát sinh liên quan đến sự điều tiết trong quá trình sinh sản cua mRNAs,
và các RNAs không sinh sản protein. Tuy nhiên, số còn lại thì được phát
sinh độc lập, không phụ thuộc vào quá trình trên, và cho đến nay, các
chuyên gia chưa định được phận sự của các RNA này
3. miRNA có thể điều tiết
sự phân giải mRNA, với sự hiện diện của RISC complex, trong trường hợp
Perfect Complementary, quá trình này được gọi là RNAi.
4. Trong trường hợp imperfect
complementary với 3'UTR của mRNA, sự chuyển hoán sẽ bị tiết giảm, và bị
chậm bớt.
5. miRNA có thể tác động
lên gần 200 RNA transcripts, và nhiều miRNA có thể tác động ảnh hưởng
điều tiết lên một Gene sinh sản protein (protein-coding Gene).
6. Các chuyên gia ước lượng
rằng hơn 50% protein-coding Genes của người đang bị kiểm soát bởi miRNA
Cơ chế của RNA-Antisense để làm trở ngại
tiến trình miRNA:
Vì miRNAs đã không giữ vai trò trực tiếp trong quá trình tổng hợp protein,
cho nên các công trình nghiên cứu về miRNA đã không được quan tâm. Khoảng
15 năm gần đây, các chuyên gia đã đề ra công trình nghiên cứu mới, nhắm
đến các giai đoạn trước khi sinh sản ra mRNA, ứng dụng song song với việc
triển khai của ngành DNA/RNA Antisense. Kết quả là họ đã tim thấy được
hoạt tính kháng ung thư trong các phòng thí nghiệm cấy mô, các hoạt tính
này cho thấy rõ được ứng dụng hữu hiệu của ngành Antisense trong các phòng
thí nghiệm.
Hammond S. M., TRENDS in Molecular Medicine, 12,
3, 99-101, 2006
Hinh 2: Tiến trình phát sinh miRNA và
thời điểm có sự tác động của miRNA Antisense Inhibitors: 1) miRNA được
sinh sản bởi RNA Polymerase II, sau khi dươc tác động bởi DROSHA trong
nhân, vòng RNA (có cấu tạo Stem-Loop), là tiền micro RNA, được gọi la
pre-miRNA, được thẩm thấu sang tế bào chất, và ở đó sẽ bị cắt bởi DICER
thành miRNA 22 nucleotides. Trong hình này, nếu miRNA kết hợp với RNA
Antisense nhân tạo Antagomir, có khả năng kết hợp mạnh hơn mRNA theo chiều
mũi tên đỏ) thì sẽ sinh ra chuỗi RNA nguyên thủy, và quá trình trở lại
từ đầu.
Hiện nay có khoảng 4167 miRNA đã được đăng ký lấy từ sinh vật như thảo mộc, visinh vật, động vật arthropods và đông vật có xương sống (vertebrates) như chim, cá, người, cho đến nay các chuyên gia đã tách ly và định cấu trúc của hơn một nghìn miRNAs cho người, và trong số đó có đến 474 miRNA (theo Hammond) đã được định tính và tất cả các chi tiết được ghi nhận trong mạng http://microrna.sanger.ac.uk.
Như vậy chúng ta có thể suy luận rằng miRNA chính là các nguồn, tiết chế quá trình sinh học của mRNA, dựa trên sự kết hợp Base-paring giữa nó, miRNA, và mRNA. Vấn đề các chuyên gia đang quan tâm là làm sao có thể làm trở ngại quá trình kết hợp này. Các chuyên gia đã thành công trong việc dùng các RNA Antisense nhân tạo chứa những gốc có vai trò làm tăng hoạt tính kết hợp base-paring complementary của RNA. Các RNA Antisense này sẽ phải có cấu trúc giống như mRNA, về base-pairing, và phải có hoạt tính kết hợp cao hơn mRNA, để có thể tác động lên miRNA, trước khi để miRNA tác động lên mRNA. Và các RNA Antisense nhân tạo đối với miRNA này, sẽ có thể làm trở ngại sự tiến hóa của quá trình này, trong cơ chế RNA Antisense.
Nhằm gia tăng tính sinh tồn (time-life), gia tăng tinh ổn định nhiệt (thermal stability), gia tăng dung điểm (melting temperature) và họat tính của các RNA nhân tạo, các chuyên gia Antisense đã dùng các phương pháp sau đây:
Biến đổi đầu 3' và 5' (3'- and 5'-ends modification) làm tăng tính sinh tồn của RNA nhân tạo: Thông thường các enzyme cắt DNA/RNA từ đầu 3' dến đầu 5', nhưng cũng có enzyme cắt từ đầu 5' đến đầu 3'. Để bảo vệ hai đầu của RNA nhân tạo, tránh khỏi phản ứng của Enzyme, người ta thường thay thế hai gốc nối phos-phát P=O ở hai đầu thành phosphorothioate, P=S, hay phosphoramidate, P-N, hay bằng các amine-linker ngắn, hay các hóa chất thông thường như Cholesterol, Cyclodextrin. Các hóa chất này có thể làm giảm hiệu năng phân giải của Enzyme, và làm tăng tính sinh tồn của RNA nhân tạo trong quá trình sinh học.
Dùng các hóa chất có tính hydrophobic, hydrophilic cao, polyamine, ở đầu 3' hay đầu 5' để làm gia tăng tính thẩm thấu qua màng tế bào, và màng nhân tế bào: nhiều thi nghiệm cho thấy rằng các hóa chất co hydrophobic cao như cholesterol, pyrene, hydrophilic cao nhu cyclodextrin, và các đa amine (polyamine)....đã giúp việc chuyển DNA/RNA qua các màng của tế bào hữu hiệu hơn.
Dùng các RNA nhân tạo với sự biến đổi các gốc 2'-Oxy để làm gia tăng ổn định nhiêt độ (Thermal Stability, melting temperature) của RNA nhân tao: 2'-Omethyl, 2'-amino, 2'-O-Alkyl, 2'-Fluoro, LNA (Lock Nucleic Acid)
Các cố gắng nghiên cứu hóa học tổng hợp nhằm sản xuất các nhóm oligonucleotides (DNA/RNA) nhân tạo mang hoạt tính có thể dùng trong y dược, đang là một đề tài sốt dẻo tại các nước tân tiên. Trong 25 năm qua, các chuyên gia trong ngành Antisense Oligonucleotides DNA/RNA đã đạt được một số thành quả ứng dụng đáng kể. Đây chính là nhân tố kích thích việc nghiên cứu trong ngành này trong những năm gần đây. Để tìm ra loại oligonucleotides DNA/RNA nhân tạo nào đó có nhiều gốc biến đổi hóa học, mà vẫn có thể hòa tan dễ dàng trong dung dich nước, có thể bền vững trong những phản ứng phân giải của Enzymes, có thể có tính kết hợp base-pairing rất chặt chẽ với các Oligonucleotides DNA/RNA thiên nhiên, và nhất là với các gốc hóa học mới này, oligonucleotides vẫn sẽ cho thấy được đặc tính ứng dụng vào y, dược trong sinh học, của nó. Mới đây, LNA (Lock Nucleic Acid, Hình 3), với cấu trúc hóa học được biến đổi, nhưng vẫn mang đủ điều kiện như một RNA nucleoside. LNA Oligonucleotides sẽ có đặc điểm là xương sống phos-phat LNA sẽ không bị dễ dàng phân giải hoàn toàn, hay biến đổi từ 3'-Oxy, sang 2'-Oxy ở trong các môi trường dung dịch với pH>7.0, và pH<7.0, các oligonucleotides thuộc loại này sẽ rất vững bền trước phản ứng của Enzymes, và co tính ổn định nhiệt lượng cao (Thermal Stability, Tm) khi có kết hợp base-pairing với các RNA thiên nhiên.
Hình 3: LNA với A, G, C, U là các base.
Cấu trúc của LNA ở trên cho thấy LNA, mang một cầu nối methylene, từ 2'-Oxy đến 4'-Carbon, đã biến nucleoside RNA này thành cấu tạo vòng kép. Và cũng vì cầu nối methylene này mà LNA oligonucleotide sẽ không ở vị trí tư do như RNA thường. Kết quả nghiên cứu của việc áp dụng biến đổi oligonucleotides thường thành oligonucleotides mang 2 vòng, vòng kép, như trường hợp LNA, hay 3 vòng, ở gốc vòng Pentafuranose (Carbohydrate), đều có tính ổn định nhiệt tăng (Thermal Stability or melting temperature, Tm, increased). LNA oligonucleotide kết hợp với DNA, hay với RNA, sẽ có dung điểm tăng lên đế +3˚C tới +4˚C, so với RNA thường kết hợp với DNA, hay RNA. Cũng vì đặc tính của cầu nối này mà các chuyên gia đã quan sát được sư gia tăng hoạt tính kháng sinh của các nucleoside có chứa vòng kép, thí dụ như Locked AZT-triphosphate, có hoạt tính mạnh hơn AZT triphosphate thuờng (Jesper Wengel et al. J.Chem. Soc., Perkin Trans.1, 1407-1414, 1999)
Hình 4: Pentafuranose của LNA (b) bị khóa không còn có dạng C2'-endo (S-type), hay C3'-endo (N-type) như trong cấu trúc của nucleotide thường (a).
Wengel et al quan sát thấy LNA không còn có dạng C2'-endo (S-type), hay C3'-endo (N-type) như trong cấu trúc của nucleotide thường (a). Mà LNA còn có cấu tạo lập thể quang hóa học vì mang vòng kép ở Pentafuranose, chỉ tồn tại dưới một dạng (b). như được mô tả trong Hình 4 trên. Cấu trúc lập thể của hai LNA oligonucleotides được diễn tả dưới đây (Wengel et al. TRENDS in Biotechnology 21, 2, 74-81, 2003).
Hình 5: LNA Với cấu trúc β-D, LNA với cấu trúc α-L
Các chuyên gia đã triển khai LNA rộng rãi hơn, bằng cách biến đổi cấu trúc sẵn có của LNA nguyên thủy để tìm cách gia tăng hoạt tính y dược của oligonucleotides, bằng cách thêm các gốc mới như methyl, amino, linkers..., hay các nguyên tố khác như Sulphur, Nitrogen, Fluorine…, hay thay đổi cấu trúc từ β-D- (Hình 5) sang β-L-cấu trúc, hai cấu trúc này có sự đối xứng qua gương phẳng (Stereoisomer), hay từ α-LNA sang α-L-LNA, hay sang xylo-LNA . Các chuyên gia vẫn quan sát thấy sự gia tăng hoạt tính sinh tồn va` ổn định nhiêt, cho cả các trường hợp LNA, α-L-LNA (Hình 5), và các LNA có cấu trúc liên quan khác, được mô tả trong Hình 6 dưới đây.
Hình 6: Các cấu trúc của các LNA, với các gốc biến đổi đã được tổng hợp, và thử nghiệm.
Tổng hợp và tinh chế RNA Antisense:
Các chuyên gia cũng đang cố gắng trong quá trình sản suất dùng máy tổng hợp DNA/RNA, đe sản xuất 400 umole Antisense RNA cho miRNA, là những đoạn RNA ngắn khoảng từ 19 - 22 nucleotides, để làm thuốc, cho ra tương đương với 10 gram sản phẩm thô. Tổng hợp RNA thì khó hơn việc tổng hợp DNA. Vì RNA mang gốc OH ở vị trí carbon 2', tương đối gần với trung tâm phản ứng phos-phat, ở vị trí carbon 3', ngay bên cạnh, trên cấu trúc vòng Pentofuranose, cua nucleotide. Hơn thế nữa gốc OH này lại phải đươc bảo vệ bởi nhóm hóa chất Alkylsilyl (thường là t-butyl-dimethyl silyl). Gốc bảo vệ này sẽ che trở cho RNA được toàn vẹn trong các công trình hậu tổng hơp. Vì RNA nguyên thủy sẽ bị dễ dàng cắt ra thành nucleoside, trong dung dịch có điều kiên pH cao (pH > 7), và xương sống oligonucleotides dễ bị chuyển hoán từ 3'-Oxy sang 2'-Oxy, trong dung dịch có điều kiên pH thấp (pH < 7), khi các gốc bảo vệ sylyl, không còn tồn tại trên RNA oligonucleotides. Các chuyên gia dùng HPLC cho thấy phẩm vật từ máy synthesizer chứa nhiều các đoạn N-minus, chất N-minus này sinh ra sau mỗi vòng phản ứng của máy, vì hiệu ứng của mỗi vòng phản ứng (~98%) thấp hơn so với hiệu ứng nhận được trong việc tổng hợp DNA (99.5%). Họ đã dùng HPLC để tinh chế, tuy nhiên các chuyên gia chỉ lấy được sản phẩm với độ tinh chế là 88%, cho lần tinh chế bằng HPLC. Dể đạt được tiêu chuẩn do Bộ Y Tế Hoa Kỳ, US-FDA đề ra là 98+% cho Antisense, các chuyên gia phải dùng phương pháp tinh chế với hai công trình HPLC, liên tiếp trong một lần tinh chế, (Double Purification Process), hoặc phải chấp nhận hiệu suất tinh chế thấp khoảng 5-10%.
Giá thành nguyên liệu sản xuất Antisense:
Việc nhắm đến tác dụng làm trở ngại RNAs, không mang vai trò liên quan trực tiếp đến quá trình của protein, là một hướng nghiên cứu y dược mới, hứa hẹn một loại thuốc có cơ chế mới, sẽ chữa trị một cách hiệu quả cho các bệnh hiểm nghèo dựa trên di truyện. Và gần đây nhiều nghiên cứu cho thấy LNA đã làm trở ngại được sự tăng trưởng của Candida albicans, khi các chuyên gia chi dùng có 8 mer LNA, va 12 mer, LNA/DNA, và với một dung dịch có nồng độ thấp là 150 nanomole, và 30 nanomole, trong phòng thí nghiệm. LNA không những đã được dùng hữu hiệu trong việc thử nghiệm kháng vi khuẩn, kháng ung thư, mà LNA còn có những tác dụng gia tăng hoạt tính trong các thuốc chẩn bênh. Giá thành của nguyên liệu phosphoramidite A,C,G,T(U) để sản xuất DNA, RNA, LNA, đã được các hãng sản xuất cho biết như sau, DNA phosphoramidites giá là 5 USD/gam, 2'Omethyl RNA giá là 35 USD /gam, và RNA giá khoảng 80 USD/gam, nếu mua với một lượng là hàng trăm ký lô gam một lần. Giá này chỉ được dùng để bán hóa chất cho các công ty lớn đang sản xuất Antisense. Các công ty hóa chất này thường bán với giá gấp đôi với giá vừa nêu ra, cho những công ty chỉ đặt mua khoảng 50 ký lô gram một lần. LNA là hóa chất mới được tổng hợp trải qua nhiều công trình hóa học cần thiết, và các công ty hóa chất chưa có công trình sản xuất thích hợp với một lượng là 100 gam, vì thế nếu đặt hàng là 5 gam thì giá là 10,000 USD/gam.
Kết Luận:
Cho đến nay đã có nhiều nghiên cứu cho thấy miRNA đã liên quan đến sự phát triển cua tế bào ung thư, như C. elegans (lin-4), và Drosophila. Và cũng có nhiều nghiên cứu cho thấy việc dùng Antisense RNA tương ứng với các miRNA này đã làm giảm được sự tăng trưởng của các tế bào ung thư này, như tế bào ung thư Hela, và 549. Và trên 50% các miRNA đã được tách ly và định tính từ các trung tâm phát bệnh ung thư. Zhang et al đã dùng high resolution array, Comparative Genomic Hybridization (CGH), phân tích cho thấy rằng trong tổng số 41 miRNA Genes, co khoảng 15% Genes đã được kiểm tra cho thấy có các copies trong 3 loại ung thư chinh: ung thư ngực (Breast Cancer), ung thư tử cung (cervical cancer), và ung thư da (melanoma). Ngành DNA Antisense đã được bắt đầu hơn 20 năm qua, và hiện đang chuyển sang một giai đoạn mới với siRNA, RNAi, và miRNA. Hy vọng Antisense RNA sẽ đưa chúng ta đến một giai đoạn công nghê cao để tìm ra phương pháp tri liệu các bệnh nan giải như bệnh ung thư.
Vũ Mạnh Huỳnh, Tiến Sĩ Hóa Học
